Desktop Gigapixel Mikroskopyo: 10 Hakbang (na may Mga Larawan)

2024 May -akda: John Day | [email protected]. Huling binago: 2024-01-30 13:13

Sa mga optical microscope, mayroong isang pangunahing trade-off sa pagitan ng field-of-view at resolusyon: mas mabuti ang detalye, mas maliit ang rehiyon na imaging ng microscope. Ang isang paraan upang mapagtagumpayan ang limitasyong ito ay upang isalin ang sample at kumuha ng mga imahe sa isang mas malaking field-of-view. Ang pangunahing ideya ay upang tahiin ang maraming mga imahe ng mataas na resolusyon upang makabuo ng isang malaking FOV. Sa mga imaheng ito, makikita mo ang parehong buong sample, pati na rin ang pinong detalye sa anumang bahagi ng sample. Ang resulta ay isang imahe na binubuo ng halos isang bilyong mga pixel, mas malaki sa paghahambing sa mga larawan na kinunan ng isang dSLR o smart phone, na karaniwang mayroong 10 hanggang 50 milyong mga pixel. Suriin ang mga tanawin ng gigapixel na ito para sa isang kahanga-hangang pagpapakita ng napakalaking impormasyon sa mga larawang ito.

Sa itinuturo na ito, pupunta ako sa kung paano bumuo ng isang mikroskopyo na may kakayahang imaging isang 90mm x 60mm na field-of-view na may mga pixel na naaayon sa 2μm sa sample (bagaman, sa palagay ko ang resolusyon ay marahil mas malapit sa 15μm). Gumagamit ang system ng mga lente ng camera, ngunit ang parehong konsepto ay maaaring mailapat gamit ang mga layunin ng mikroskopyo upang makakuha ng mas pinong resolusyon.

Na-upload ko ang mga gigapixel na imahe na nakuha ko gamit ang microscope sa EasyZoom:

Imahe ng magazine ng National Geographic

Gantsilyo sa tablecloth ang ginawa ng aking asawa

Sari-saring electronics

Iba pang mga mapagkukunan:

Mga tutorial na optikal na mikroskopya:

Resolusyon ng optiko: https://en.wikipedia.org/wiki/Diffraction- Unlimited_…

Bilang karagdagan sa stitching ng imahe, ang kamakailang pag-unlad sa computational imaging ay ginagawang posible ang gigapixel microscopy nang hindi nililipat ang sample!

Hakbang 1: Listahan ng Supply

Mga Materyales:

1. Nikon dSLR (Ginamit ko ang aking Nikon D5000)

2. 28mm focal haba ng lens na may 52mm threading

3. 80mm focal haba ng lens na may 58mm na threading

4. 52mm hanggang 58mm reverse coupler

5. Tripod

6. Pitong sheet ng 3mm makapal na playwud

7. Arduino Nano

8. Dalawang H-tulay L9110

9. Dalawang IR emitter

10. Dalawang tatanggap ng IR

11. Push button

12. Dalawang 2.2kOhm resistors

13. Dalawang resistor na 150Ohm

14. Isang resistor ng 1kOhm

15. Remote na paglabas para sa Nikon camera

16. Itim na board board

17. Hardware kit:

18. Dalawang stepper motor (Gumamit ako ng Nema 17 Bipolar step motor 3.5V 1A)

19. Dalawang 2mm lead screws

20. Apat na mga bloke ng unan

21. Dalawang lead screw nut

22. Dalawang tindig na slide bushing at 200mm linear shafts:

23. 5V power supply:

24. Wire wrap wire

Mga tool:

1. Laser cutter

2. 3D printer

3. Mga wrenches ni Allen

4. Mga pamutol ng wire

5. Kasangkapan sa balot ng wire

Hakbang 2: Pangkalahatang-ideya ng System

Upang isalin ang sample, ang dalawang mga stepper motor ay nakahanay sa mga direksyon ng orthogonal ilipat ang isang yugto sa x at y direksyon. Ang mga motor ay kinokontrol gamit ang dalawang H-tulay at isang Arduino. Ang isang IR sensor na nakaposisyon sa base ng stepper motor ay ginagamit upang zero ang mga yugto upang hindi sila tumakbo sa alinmang dulo ng mga bloke. Ang isang digital microscope ay nakaposisyon sa itaas ng yugto ng XY.

Kapag nakaposisyon na ang sample at nakasentro ang yugto, pinindot mo ang isang pindutan upang simulan ang acquisition. Inililipat ng mga motor ang entablado sa ibabang kaliwang sulok at ang camera ay na-trigger. Isinalin ng mga motor ang sample sa maliliit na hakbang, dahil kumukuha ng larawan ang camera sa bawat posisyon.

Matapos ang lahat ng mga imahe ay kinunan, ang mga imahe ay pagkatapos ay stitched magkasama upang bumuo ng isang gigapixel imahe.

Hakbang 3: Assembly ng Mikroskopyo

Gumawa ako ng isang mababang mikroskopyo na nagpapalaki na may dSLR (Nikon 5000), isang Nikon 28mm f / 2.8 lens, at isang Nikon 28-80mm zoom lens. Ang zoom lens ay itinakda para sa haba ng focal na katumbas ng 80mm. Ang hanay ng dalawang lente ay kumikilos tulad ng isang microscope tube lens at layunin na lens. Ang kabuuang pagpapalaki ay ang ratio ng mga focal haba, sa paligid ng 3X. Ang mga lente na ito ay talagang hindi idinisenyo para sa pagsasaayos na ito, kaya upang ang ilaw ay kumalat tulad ng isang mikroskopyo, kailangan mong iposisyon ang isang aperture stop sa pagitan ng dalawang lente.

Una, i-mount ang mas mahahabang lens ng haba sa camera. Gupitin ang isang bilog sa itim na board board na may lapad na halos ang laki ng harap na ibabaw ng lens. Pagkatapos ay gupitin ang isang maliit na bilog sa gitna (pumili ako ng tungkol sa 3mm diameter). Ang laki ng bilog ay matutukoy ang dami ng ilaw na pumapasok sa system, na tinatawag ding numerical aperture (NA). Tinutukoy ng NA ang pag-ilid na resolusyon ng system para sa mahusay na dinisenyo na mga mikroskopyo. Kaya bakit hindi gumamit ng isang mataas na NA para sa pag-setup na ito? Sa gayon, mayroong dalawang pangunahing mga kadahilanan. Una, habang tumataas ang NA, ang mga optikal na aberrations ng system ay magiging mas kilalang at lilimitahan ang resolusyon ng system. Sa isang hindi kinaugalian na pag-set up tulad nito, malamang na ito ang magiging kaso, kaya't ang pagdaragdag ng NA sa kalaunan ay hindi na makakatulong mapabuti ang resolusyon. Pangalawa, ang lalim ng larangan ay nakasalalay din sa NA. Kung mas mataas ang NA, mas mababaw ang lalim ng patlang. Pinahihirapan nitong makuha ang mga bagay na hindi flat ang lahat sa pagtuon. Kung ang NA ay napakataas, pagkatapos ikaw ay limitado sa mga imaging slide ng mikroskopyo, na may manipis na mga sample.

Ang pagpoposisyon ng aperture stop sa pagitan ng dalawang lente ay ginagawang telecentric ang system. Nangangahulugan iyon na ang paglaki ng system ay malaya sa distansya ng object. Nagiging mahalaga ito para sa tahi ng mga imahe nang magkasama. Kung ang bagay ay may iba't ibang lalim, kung gayon ang pagtingin mula sa dalawang magkakaibang posisyon ay maglilipat ng pananaw (tulad ng paningin ng tao). Ang pagtahi ng mga imahe nang magkasama na hindi mula sa isang telecentric imaging system ay mapaghamong, lalo na sa napakataas na pagpapalaki.

Gamitin ang 58mm hanggang 52mm lens reverse coupler upang ikabit ang 28mm lens sa 80mm lens na nakaposisyon ang aperture sa gitna.

Hakbang 4: Disenyo ng XY Stage

Dinisenyo ko ang entablado gamit ang Fusion 360. Para sa bawat direksyon sa pag-scan, mayroong apat na bahagi na kailangang naka-print na 3D: mounter mount, dalawang slide unit extender, at isang mount screw mount. Ang base at platform ng yugto ng XY ay pinutol ng laser mula sa 3mm makapal na playwud. Hawak ng base ang X-direction na motor at mga slider, ang X-platform ay humahawak ng motor na Y-direction at mga slider, at ang Y-platform ay humahawak ng sample. Ang base ay binubuo ng 3 sheet at ang dalawang platform ay binubuo ng 2 sheet. Ang mga file para sa pagputol ng laser at pag-print ng 3D ay ibinibigay sa hakbang na ito. Matapos i-cut at i-print ang mga bahaging ito handa ka na para sa mga susunod na hakbang.

Hakbang 5: Motor Mount Assembly

Gamit ang isang wire-wrap tool, balutin ang wire sa mga lead ng dalawang IR emitter at dalawang IR receivers. Kulay ng code ang mga wires upang malaman mo kung aling dulo ang alin. Pagkatapos ay gupitin ang mga lead sa mga diode, kaya't ang mga wire wire wire lamang ang tumakbo mula noon. I-slide ang mga wire sa pamamagitan ng mga gabay sa motor mount at pagkatapos ay itulak ang mga diode sa lugar. Ang mga wire ay nakadirekta sa gayon hindi sila nakikita hanggang sa lumabas sila sa likuran ng yunit. Ang mga wires na ito ay maaaring isali sa mga wire ng motor. Ngayon i-mount ang stepper motor gamit ang apat na M3 bolts. Ulitin ang hakbang na ito para sa pangalawang motor.

Hakbang 6: Assembly ng Stage

Isama ang pandikit sa pagbawas ng Base 1 at Base 2, isa sa mga ito na may hexagonal openings para sa mga M3 nut. Kapag ang kola ay tuyo, martilyo ang M3 mani sa posisyon. Ang mga mani ay hindi paikutin kapag pinindot sa pisara, kaya't magagawa mong i-tornilyo sa mga bolt sa paglaon. Ngayon kola ang pangatlong base sheet (Base 3) upang masakop ang mga mani.

Ngayon ay oras na upang tipunin ang lead-nut mount. I-clear ang anumang labis na filament mula sa bundok at pagkatapos ay itulak ang apat na M3 nut sa posisyon. Ang mga ito ay isang masikip na akma, kaya siguraduhing tinanggal mo ang bolt at nut space sa isang maliit na driver ng tornilyo. Kapag ang mga mani ay nakahanay, itulak ang lead-nut sa bundok at ilakip ito sa 4 M3 bolts.

Ikabit ang mga bloke ng unan, slider mount, at motor mount para sa X-direction linear translator papunta sa base. Ilagay ang pagpupulong ng nut nut sa lead screw at pagkatapos ay i-slide ang lead screw sa lugar. Gamitin ang coupler upang ikonekta ang motor sa lead screw. Ilagay ang mga yunit ng slider sa mga rod at pagkatapos ay itulak ang mga rod sa slider mount. Sa wakas, ikabit ang slider mount extender na may M3 bolts.

Ang mga sheet ng X1 at X2 na playwud ay nakadikit sa isang katulad na paraan sa base. Ang parehong pamamaraan ay paulit-ulit para sa tagasalin ng linear na direksyon ng Y at ang sample na yugto.

Hakbang 7: Scanner Electronics

Ang bawat stepper motor ay may apat na mga cable na konektado sa isang H-bridge module. Ang apat na mga cable mula sa IR emitter at receiver ay konektado sa resistors ayon sa diagram sa itaas. Ang mga output ng mga tatanggap ay konektado sa analog input A0 at A1. Ang dalawang mga H-bridge module ay konektado sa pin 4-11 sa Arduino Nano. Ang isang pushbutton ay konektado sa pin 2 na may isang 1kOhm risistor para sa simpleng pag-input ng gumagamit.

Sa wakas ang pindutan ng pag-trigger para sa dSLR ay konektado sa isang remote shutter, tulad ng ginawa ko para sa aking CT scanner (tingnan ang hakbang 7). Gupitin ang remote shutter cable. Ang mga wire ay may label bilang sumusunod:

Dilaw - pokus

Pula - shutter

Puti - lupa

Upang maituon ang pagbaril, ang dilaw na kawad ay dapat na konektado sa lupa. Upang makunan ng larawan, ang parehong dilaw at pula na kawad ay dapat na konektado sa lupa. Ikinonekta ko ang isang diode at ang pulang cable upang i-pin ang 12, at pagkatapos ay kumonekta ako ng isa pang diode at ang dilaw na cable upang i-pin 13. Ang setup ay tulad ng inilarawan sa DIY Hacks at How-Tos na itinuturo.

Hakbang 8: Pagkuha ng Mga Larawan ng Gigapixel

Nakalakip ang code para sa gigapixel microscope. Ginamit ko ang aklatan ng Stepper para sa pagkontrol ng mga motor sa H-bridge. Sa simula ng code, dapat mong tukuyin ang field-of-view ng microscope at ang bilang ng mga imahe na nais mong makuha sa bawat direksyon.

Halimbawa, ang microscope na ginawa ko ay nagkaroon ng isang field-of-view na halos 8.2mm x 5.5mm. Samakatuwid, itinuro ko ang mga motor na ilipat ang 8mm sa x-direction at 5mm sa y-direction. 11 mga imahe ang nakuha sa bawat direksyon, na may kabuuan na 121 mga imahe para sa buong gigapixel na imahe (higit pang mga detalye tungkol dito sa hakbang 11). Kinakalkula ng code ang bilang ng mga hakbang na kailangang gawin ng mga motor upang isalin ang yugto sa halagang ito.

Paano malalaman ng mga yugto kung saan sila nauugnay sa motor? Paano isalin ang mga yugto nang hindi pinindot ang alinman sa dulo? Sa setup code, nagsulat ako ng isang pagpapaandar na gumagalaw sa entablado sa bawat direksyon hanggang sa masira nito ang landas sa pagitan ng IR emitter at IR receiver. Kapag ang signal sa IR receiver ay bumaba sa ibaba ng ilang threshold, huminto ang motor. Sinusubaybayan ng code ang posisyon ng entablado na may kaugnayan sa posisyon sa bahay na ito. Ang code ay nakasulat sa gayon ang motor ay hindi nagsalin ng napakalayo na maaaring magpatakbo ng entablado sa kabilang dulo ng lead screw.

Kapag ang entablado ay naka-calibrate sa bawat direksyon, ang yugto ay isinalin sa gitna. Gamit ang isang tripod, nakaposisyon ko ang aking dSLR microscope sa ibabaw ng entablado. Mahalagang ihanay ang patlang ng camera sa mga naka-cross line sa sample na yugto. Kapag nakahanay ang entablado sa camera, nag-tap down ako sa entablado gamit ang tape ng pintura at pagkatapos ay inilagay ang sample sa entablado. Ang pokus ay nababagay sa tripod z-direction. Pagkatapos ay pinindot ng gumagamit ang pushbutton upang simulan ang acquisition. Ang entablado ay isinasalin sa ibabang kaliwang sulok at ang camera ay napalitaw. Ang entablado pagkatapos ay sinusuri ng raster ang sample, habang ang camera ay nag-snap ng isang larawan sa bawat posisyon.

Nakalakip din ang ilang code para sa pag-troubleshoot ng mga motor at IR sensor.

Hakbang 9: Mga Stitching Images

Sa lahat ng mga nakuha na imahe, nahaharap ka ngayon sa hamon ng pag-stitch ng lahat ng ito. Ang isang paraan upang hawakan ang tahi ng imahe ay sa pamamagitan ng manu-manong pag-align ng lahat ng mga imahe sa isang graphic program (Ginamit ko ang Graphic ng Autodesk). Tiyak na gagana ito, ngunit maaari itong maging isang masakit na proseso at ang mga gilid ng mga imahe ay kapansin-pansin sa mga gigapixel na imahe.

Ang isa pang pagpipilian ay ang paggamit ng mga diskarte sa pagproseso ng imahe upang awtomatikong tahiin ang mga imahe. Ang ideya ay upang makahanap ng mga katulad na tampok sa magkakapatong na seksyon ng mga katabing larawan at pagkatapos ay maglapat ng isang pagsasalin ng pagbabago sa imahe upang ang mga imahe ay nakahanay sa isa't isa. Panghuli, ang mga gilid ay maaaring pagsamahin nang magkasama sa pamamagitan ng pagpaparami ng magkakapatong na seksyon ng isang linear weight factor at pagdaragdag ng mga ito nang magkasama. Maaari itong maging isang nakakatakot na algorithm upang isulat kung bago ka sa pagproseso ng imahe. Nagtrabaho ako sandali sa problema, ngunit hindi ako nakakuha ng isang ganap na maaasahang resulta. Pinakahirap ng algorithm ang mga sample na may halos katulad na mga tampok sa buong, tulad ng mga tuldok sa imahe ng magazine. Nakalakip ang code na isinulat ko sa Matlab, ngunit kailangan nito ng kaunting trabaho.

Ang huling pagpipilian ay ang paggamit ng mga programang stitching ng gigapixel photography. Wala akong iminumungkahi, ngunit alam kong nandoon sila sa labas.

Hakbang 10: Pagganap ng Mikroskopyo

Kung sakaling napalampas mo ito, narito ang mga resulta: imahe ng magazine, tabrecloth ng gantsilyo, at sari-saring electronics.

Ang mga detalye ng system ay nakalista sa talahanayan sa itaas. Sinubukan ko ang imaging gamit ang parehong 28mm at 50mm na focal haba ng lens. Tinantya ko ang pinakamahusay na posibleng resolusyon ng system batay sa limitasyon ng diffraction (sa paligid ng 6μm). Talagang mahirap subukan ito nang eksperimento nang walang target na mataas na resolusyon. Sinubukan kong mag-print ng isang vector file na nakalista sa malaking format na forum ng pagkuha ng litrato, ngunit nalimitahan ako ng resolusyon ng aking printer. Ang pinakamahusay na matutukoy ko sa printout na ito ay ang sistema na may resolusyon <40μm. Naghanap din ako ng maliliit, nakahiwalay na tampok sa mga sample. Ang pinakamaliit na tampok sa pag-print mula sa magazine ay ang tinta na lugar, na tinantya ko rin na halos 40μm, kaya hindi ko ito magamit upang makakuha ng isang mas mahusay na pagtatantya para sa resolusyon. Mayroong maliliit na divot sa electronics na medyo napahiwalay. Dahil alam ko ang field-of-view, mabibilang ko ang bilang ng mga pixel na kumukuha ng maliit na divot upang makakuha ng isang pagtatantya ng resolusyon, mga 10-15μm.

Sa pangkalahatan, masaya ako sa pagganap ng system, ngunit mayroon akong ilang mga tala kung sakaling nais mong subukan ang proyektong ito.

Katatagan ng yugto: Una, kumuha ng mataas na kalidad na mga bahagi ng linear na yugto. Ang mga sangkap na ginamit ko ay may higit na paglalaro kaysa sa inaakalang gusto ko. Ginamit ko lamang ang isa sa mga slider mount sa kit para sa bawat pamalo, kaya marahil iyon ang dahilan kung bakit hindi gaanong matatag ang yugto. Ang entablado ay gumana ng sapat para sa akin, ngunit ito ay magiging higit na isang isyu para sa mas mataas na mga sistema ng pagpapalaki.

Mga optika para sa mas mataas na resolusyon: Ang parehong ideya ay maaaring magamit para sa mas mataas na mga mikroskopyo ng pagpapalaki. Gayunpaman, kakailanganin ang mas maliit na mga motor na may finer na laki ng hakbang. Halimbawa Gumamit ang electronupdate ng mga stepper motor mula sa isang CD player sa isang magandang build para sa isang mas mataas na microscope ng pagpapalaki. Ang isa pang tradeoff ay magiging mababaw na lalim ng patlang, na nangangahulugang ang imaging ay limitado sa manipis na mga sample at kakailanganin mo ng mas pinong mekanismo ng pagsasalin sa z-direction.

Katatagan ng tripod: Ang system na ito ay gagana nang mas mahusay sa isang mas matatag na mount camera. Ang sistema ng lens ay mabigat at ang tripod ay ikiling 90deg mula sa posisyon kung saan ito ay dinisenyo. Kailangan kong i-tape ang mga paa ng tripod upang makatulong sa katatagan. Ang shutter ay maaari ring kalugin ang camera nang sapat upang lumabo ang mga imahe.